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Molekulargenetik

Einzelgenanalyse

Bei der Einzelgenanalyse handelt es sich um eine gezielte genetische Untersuchungsmethode auf DNA- oder RNA-Ebene, welche sich ideal für die Abklärung von Erkrankungen eignet, die mit einem oder wenigen Genen assoziiert sind.

Für eine solche Einzelgenanalyse werden mittels Sanger-Sequenzierung die codierenden Bereiche (Exons) mit flankierenden intronischen Regionen der entsprechenden Gene untersucht. Aufgrund technischer Limitierung dieser Methodik (z.B. aufgrund von Allel-Dropout, Mosaizismus) kann es bei der Sanger-Sequenzierung in seltenen Fällen vorkommen, dass Veränderungen nicht erkannt werden.

Eine spezielle Anforderung im Rahmen der Einzelgenanalyse ist die Untersuchung von Repeat-Expansionen (z.B. Huntington, SCA, Kennedy). Kleinere Repeats können in-house mittels Fragmentanalyse analysiert werden. Die Sequenzierung erfolgt mit den Sequencern „3500 Genetic Analyzer“ (Thermo Fisher Scientific) und „3500xl Genetic Analyzer“ (Thermo Fisher Scientific); die Auswertung erfolgt mit SeqPilot (JSI medical systems). Die Beschreibung und Einstufung der identifizierten Veränderungen erfolgt nach einer international gültigen Nomenklatur basierend auf den HGVS- und ACMG-Richtlinien (http://www.hgvs.org/content/guidelines; Richards et al., Genet. Med. 2015, 17(5): 405-424).

Bei der DNA-Analyse wird aus dem zugesandten Material (i.d.R. EDTA-Blut oder Gewebe) die genomische DNA extrahiert und dann werden die interessierten Bereiche mit spezifischen Primern mittels PCR amplifiziert und sequenziert. Zusätzlich zur Sanger-Sequenzierung wird bei der DNA-Analyse, falls verfügbar, standardmäßig auch eine Untersuchung auf Duplikationen und Deletionen einzelner Exons bzw. Gene mittels MLPA-Kits (MRC Holland) durchgeführt. Sollte kein MLPA-Kit verfügbar sein und der Verdacht auf eine Deletion bzw. Duplikation vorliegen, besteht die Möglichkeit für die Analyse eine quantitative PCR zu etablieren. Für große Deletionen, die mehrere Gene betreffen, empfiehlt sich eine Array-CGH-Analyse.

Sollte eine eindeutige Einstufung einer bereits identifizierten Veränderung im Spleißbereich nicht möglich sein, kann eine RNA-Analyse zum Einsatz kommen. Hierbei wird aus EDTA-Blut oder Gewebe eine Lymphozyten bzw. Fibroblastenkultur angesetzt und zur Unterdrückung des vorzeitigen Abbaus aberranter Transkripte mit Puromycin versetzt. Anschließend wird die mRNA mittels einer reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben und sangersequenziert. Diese Analyse wird momentan standardmäßig für Gene bei welchen pathogene intronische Mutationen häufig kausal für die entsprechende Erkrankung sind (Neurofibromatose Typ 1) bzw. bei aufgrund von Pseudogenen schwierig zu sequenzierenden Genen (PMS2). Bei unklarer Einstufung einer potentiellen Spleißmutation bzw. auf Nachfrage, versuchen wir gerne eine RNA-Analyse für das entsprechende Gen zu etablieren. Je nachdem ob die Transkripte des entsprechenden Gens in den Blutzellen exprimiert werden benötigen wir für die Untersuchung eine EDTA-Blutprobe oder eine Gewebeprobe (z.B. Hautstanze).

Next-Generation Sequenzierung (NGS)

Bei Indikationen, für die mehrere Gene mit ursächlichen Veränderungen bekannt sind, oder falls die Symptomatik nicht auf eine bestimme Erkrankung eingegrenzt werden kann, empfiehlt sich aus Zeit- und Kostengründen meistens eine Exomanalyse (WES) mittels Next-Generation-Sequenzierung. Die Next-Generation Sequenzierung erlaubt durch massive Parallelsequenzierung einen ungleich höheren Sequenzierungsdurchsatz als die herkömmliche Sangersequenzierung. Hierbei werden die codierenden Bereiche aller bekannten Gene sequenziert und analysiert. Zusätzlich kann eine Auswertung der CNVs (copy number variations) erfolgen. Die Exomanalyse wird von uns an einem NextSeq500 (Illumina) durchgeführt und mit „VarSeq“ (GoldenHelix) ausgewertet. Die Beschreibung und Einstufung der identifizierten Veränderungen erfolgt nach einer international gültigen Nomenklatur basierend auf den HGVS- und ACMG-Richtlinien (http://www.hgvs.org/content/guidelines; Richards et al., Genet. Med. 2015, 17(5): 405-424).